Con el auge de la investigación de las terapias avanzadas, celulares y génicas, los procesos de criopreservación, y por tanto las instalaciones asociadas, adquieren un valor muy relevante, sobre todo en el ámbito de la I+D+i. Se trata de la aplicación de técnicas basadas en la congelación de muestras con crioconservantes, con el fin de alargar la vida útil de estas, garantizando la no alteración de sus características y estructuras esenciales, una vez se vuelven a descongelar.

Concretamente, el proceso de criopreservación consigue que las células sean congeladas a muy bajas temperaturas mediante un proceso de control de la curva de nucleación, generalmente entre -160 °C y -196 °C. Esta última temperatura es el punto de ebullición del nitrógeno líquido (N2L). Con ello, se consigue disminuir las funciones vitales de las células y se mantienen en condiciones de vida suspendida durante tiempos prolongados. A esas temperaturas, cualquier actividad biológica, incluidas las reacciones bioquímicas que producen la muerte de la célula, quedan detenidas de forma efectiva. Los métodos y técnicas de criopreservación deben garantizar alcanzar las bajas temperaturas indicadas, sin producir daños adicionales causados por la formación de hielo durante la congelación.

Con este objetivo se deben aplicar procedimientos y controles exhaustivos, con la ayuda de equipamientos específicos denominados comúnmente congeladores programables, garantizando que la curva de congelación aplicada, nucleación anteriormente mencionada, cumple con todas las premisas necesarias para la correcta criopreservación. No aplicar estas medidas de control puede provocar la pérdida de las muestras, lo que en ocasiones puede suponer costes incalculables, personales o materiales.

A parte de la necesidad de disponer de congeladores programables para garantizar el éxito de la criopreservación, las instalaciones criogénicas, herramientas y elementos auxiliares, adquieren su gran relevancia mediante infraestructuras y equipos que deben garantizar un proceso global óptimo, eficaz y, cada vez más, eficiente.

Estas áreas deberán contener accesos restringidos a personal capacitado y conocedor de los riesgos que implica un área con nitrógeno y equipos a presión. La instalación o instalaciones deben estar señalizadas correctamente según RD 485/1997, basándose en la guía de buenas prácticas de la NTP 566.

La instalación tipo suele disponer de un depósito principal de gran capacidad, el cual recibe las cargas periódicas por parte de la empresa suministradora de gases contratada, habitualmente solicitadas desde la propia instalación, mediante su sistema de control automático, ubicado en el cuadro eléctrico o de control. La instalación sigue a través de una red de distribución de tuberías y válvulas. Cabe la posibilidad de disponer de depósitos de almacenamiento intermedios para dar suministro a actividades o equipos específicos. Y finalmente los depósitos criogénicos, que almacenan las muestras en fase gas o fase líquido, ya sea a -160ºC o -196ºC, respectivamente. Tanto el depósito de suministro principal como aquellos posibles depósitos intermedios de almacenamiento para suministrar a otros dispositivos, se rigen por la normativa Reglamento de Equipos a Presión y sus Instrucciones Técnicas Complementarias del Real Decreto 2060/2008 (normativa que se encuentra en proceso de revisión, cuya modificación está prevista para este año 2020), y su reglamentación relativa a Instrucciones Técnicas Complementarias, ITC-EP-4: Depósitos criogénicos. La instalación debe disponer de elementos de seguridad activos en todo momento, tales como válvulas de seguridad, discos de roturas o limitadores de presión, para garantizar el correcto control.

La infraestructura o espacio de almacenamiento debe ser lo más aséptica posible, con el fin de garantizar un entorno adecuado de manipulación de muestras y paralelamente asegurar que cualquier tipo de suciedad no se introduzca en los depósitos criogénicos ni afecte al proceso. Es conveniente que las tuberías de suministro de nitrógeno líquido sean aisladas al vacío, habitualmente mediante instalación de doble camisa (doble tubo concéntricos), al menos en la conexión entre el depósito principal hasta la red de distribución en la sala, no incluyendo los latiguillos de conexión a los depósitos criogénicos, con el fin de minimizar la pérdida de carga térmica del líquido. Se debe proveer de una adecuada suportación y aislamiento de válvulas y tuberías que no sean al vacío, evitando así puntos de condensación.

La sala de almacenamiento debe cumplir una serie de renovaciones de aire por hora mínimas, en función del volumen total de la estancia, para garantizar que las concentración de oxígeno (O2) es la adecuada, eliminando posibles concentraciones de nitrógeno gas (N2) derivado de manipulaciones o cargas de depósitos. Esta característica técnica está relacionado con la seguridad de las personas que trabajan en el área. El nitrógeno, se presenta en estas instalaciones como gas comprimido (licuado), inerte, no respirable, inodoro, incoloro e insípido. No es tóxico ni corrosivo, pero al entrar en contacto con temperaturas ambiente (habitualmente se define dicha temperatura entre 20-25ºC) produce un proceso de gasificación, cuya temperatura es próxima a -160ºC, y con la particularidad de que desplaza el oxígeno. Cuando aumenta su proporción en el aire, debido a procesos asociados a cargas, manipulaciones, mantenimientos u otros, puede llegar a ocasionar mareos o incluso asfixia, debido a la falta de entrada de oxígeno (suboxigenación), incluso provocando asfixia y la denominada muerte dulce. Se observa que las personas expuestas a la inhalación de nitrógeno pueden sentir un aumento de fatiga o de descoordinación de movimientos.

Por tanto, valores por debajo de un 19% de oxígeno en el ambiente, detectados por sensores de células de O2, deben provocar una alarma visual y acústica para facilitar la detección por parte de los/las usuarios/as de la instalación, los/as cuales deben aplicar protocolos de seguridad, tales como abandonar el área, o forzar renovaciones o extracciones del aire de la sala. Las instalaciones criogénicas disponen, por normativa de seguridad, de estos puntos de detección (sensores de detección de oxígeno), cuya medida se suele presentar habitualmente en %. El número de sensores a instalar vendrá supeditado a las normas técnicas que rigen dichas instalaciones. Este cálculo es resultante de los valores de área y volumen global de la instalación. Procedimientos de trabajo tales como realizar las labores en parejas en la sala, o monitorización por video vigilancia, también son usuales en zonas de este tipo para garantizar la seguridad, en este caso, de las personas. En caso de observar o detectar cualquier anomalía en los trabajadores de la estancia, personal debidamente capacitado debe socorrerles, tras equiparse con sistemas de respiración autónoma, evitando así riesgos de la persona que aporta la ayuda.

La infraestructura debe disponer de una instalación eléctrica adecuadamente dimensionada, con los elementos de protección según normativas vigentes y es muy necesario disponer de dispositivos de control, como por ejemplo un PLC (Programmable Logic Controler), para programación y control de tareas asiduas tales como el enfriamiento de las líneas de nitrógeno previo a cargas, evitando así cargas en fase vapor (gas), hecho que aumenta el consumo no eficiente de nitrógeno. Desde el PLC también se pueden gestionar alarmas propias de los depósitos. Es muy conveniente disponer siempre de sistemas alternativos de alimentación eléctrica a esta instalación (ya sea mediante grupos electrógenos o Sistemas de Alimentación Ininterrumpida, SAI).

Los elementos de control básicos, para el correcto funcionamiento de una instalación criogénica, son:

• Limpieza del área y depósitos: se debe disponer de un entorno lo más aséptico posible, en función de la actividad desarrollada, para evitar posibles contaminaciones, incluso mal funcionamiento de equipos.

• Temperatura: se debe controlar la temperatura de la zona de almacenamiento para evitar la excesiva evaporación o la generación de condensación. Debe prevenirse la filtración de agua al interior de los recipientes; en equipos automáticos esto puede suponer graves fallos de funcionamiento (rotores atascados por congelación, elementos eléctricos afectados, etcéteraéteraétera).

• Humedad: también relacionado con la condensación en los equipos. Muchos equipos criogénicos de almacenamiento de muestras son estrictamente sensibles a valores de humedad relativa superiores al 60%.

• Telemetría – control de alarmas: posibilidad de controlar la instalación desde cualquier punto mediante conexiones informáticas (fibra óptica, ADSL, Router, GSM, etcéteraéteraétera). Todo ello facilitará el control de las posibles alarmas de la instalación, ya sean propias o de los depósitos (alarmas de nivel, alarmas de comunicación, etcéteraétera.).

Debido a la sensibilidad de los productos criopreservados y su complejidad de manejo a temperaturas tan extremas, es estrictamente necesario mantener y disponer de un inventario correctamente gestionado. Las muestras, suelen almacenarse en racks dentro de los depósitos. Se debe evitar también la exposición de las muestras a temperaturas fuera de los márgenes óptimos de conservación. En el trasiego y manipulación de cualquier muestra en depósitos de criopreservación, ya sea para inserciones o extracciones, el control ha de ser continuo, según los términos anteriormente descritos, y siempre mediante el uso de herramientas y soportes físicos que permitan la integridad y el mantenimiento de las condiciones necesarias para conseguir que el producto sea válido y viable. Cualquier alteración de las condiciones o el uso inadecuado de los elementos auxiliares, tales como pinzas, los propios guantes, elementos asociados al proceso de descongelación, etcéteraétera., puede provocar que el producto se dañe, dejando de ser en muchas ocasiones aceptable.

Todo ello favorecerá a que los profesionales se expongan a menores riesgos en la búsqueda y manipulación de las muestras. Es importante remarcar que en un proceso de criopreservación, el producto se convierte en un elemento similar a un cristal sumamente sensible, pudiéndose provocar fácilmente roturas en los embalajes usuales (habitualmente plásticos o equivalentes, preparados para temperaturas criogénicas). Es por ello, que la manipulación de productos o muestras criopreservadas se debe realizar con sumo cuidado.
Toda la instalación y equipos asociados deben de estar sometidos a mantenimientos normativos, preventivos, predictivos (si se tiene capacidad) y conductivos, y en los casos necesarios correctivos y/o curativos. Es esencial disponer de una adecuada planificación, habitualmente anual, de estos mantenimientos, coordinada en todo momento con los procesos asociados.

Por último, y no menos importante, asociado a la capacitación anteriormente indicada, el personal técnico debe hacer uso siempre de los EPI (Equipos de Protección Individual) para la manipulación de productos criogénicos. La definición de un procedimiento de manipulación de productos almacenados en nitrógeno, así como las normas referentes a la Prevención de Riesgos Laborales, son indispensables para garantizar la seguridad de las personas y las muestras.

En conclusión, para una gestión eficiente de conservación de células se debe cumplir con el trinomio descrito: Procedimientos validados + Instalaciones y equipos eficaces y eficientes + Personal técnico capacitado.

 

Iván Cano Chaves